膜蛋白抽提试剂盒

更新:2019-1-9 16:02:59

中文名:膜蛋白抽提试剂盒说明书下载暂无
英文名:Membrane Protein Extraction Kit
描述:本试剂盒采用独特的组分,提取细胞及组织中的膜蛋白。特殊的溶液系统,在裂解细胞的同时,还可以选择性低地分离提取细胞膜蛋白与细胞器膜蛋白。提取方法简单,可靠,快速,获得的膜蛋白纯度高,可用于SDS-PAGE电泳、Western Blot、免疫沉淀等后续实验,每次可以提取107个培养细胞或200mg动物组织。
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    G4420-150T325GBCBIO
    G4420-2100T582GBCBIO
产品介绍

    本试剂盒采用独特的组分,提取细胞及组织中的膜蛋白。特殊的溶液系统,在裂解细胞的同时,还可以选择性低地分离提取细胞膜蛋白与细胞器膜蛋白。提取方法简单,可靠,快速,获得的膜蛋白纯度高,可用于SDS-PAGE电泳、Western Blot、免疫沉淀等后续实验,每次可以提取107个培养细胞或200mg动物组织。

    储存和稳定性

     常温运输,收到后,DTT在-20℃保存,其余组分4℃保存,一年有效。

    注意事项:

              需自备PMSF。PMSF要在抽提前2-3分钟内加入,以免PMSF在水溶液中很快失效。

              浓缩洗涤液需要去离子水洗涤后再使用。

              使用本试剂盒抽提到的细胞核蛋白与细胞浆蛋白均可直接用GBCBIO的BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度或Lowry法测定蛋白浓度。

              为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

    使用说明:

    1.准备细胞或组织样品:

    A 细胞

    贴壁细胞:培养约2000-5000万细胞,用PBS洗一遍,用细胞刮子刮下细胞或用含有EDTA但不含胰酶的细胞消化液处理细胞使细胞不再贴壁很紧,并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞,吸除上清,留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞,以免胰酶降解需抽提的目的膜蛋白。

    悬浮细胞:培养约2000-5000万细胞,直接离心收集细胞,吸除上清,留下细胞沉淀备用。

    B. 对于组织:

    取约100毫克组织,用剪刀尽量小心剪切成细小的组织碎片

    2.样品洗涤:用适量的已稀释的洗涤液洗涤样品三次,每次3000rpm离心2min。

    3.样品裂解:在上述细胞或组织中加入1ml蛋白提取液(使用前加入PMSF,终浓度为1mM,与2.5μl DTT),4℃下用玻璃匀浆器手动上下手动匀浆30-50次。或者用  超声波破碎细胞,每次30s,3-4次,每次间隔1分钟,置于冰上冷却。细胞破碎后应经镜检,细胞破碎率不小于70%,无明显的组织块。

    镜检:通常可以在匀浆30次后取约2-3微升细胞或组织匀浆液滴在盖玻片上并在显微镜下观察,如见细胞核周晕环(A shiny ring around the nuclei)或完整的细胞形态,说明细胞仍完整。如果有70-80%的细胞均无核周晕环和完整细胞形态,说明细胞已经充分破碎,则进行下一步实验。否则,重新匀浆10-30次直到细胞至少70%已经破碎。同时记录对于该细胞的匀浆次数,通常在后续实验时不必再摸索匀浆次数。另外需注意特定的匀浆次数和匀浆器也有关,需同时注意记录使用的是哪一个匀浆器。

        注:如果没有适当的玻璃匀浆器,对于培养的细胞也可以采用冻融法来破碎细胞。把步骤2中的样品在液氮和室温依次反复冻融两次,然后取少量样品在显微镜下检测细胞破碎的程度。如果细胞破碎的程度不足70%,可增加冻融次数,直到细胞破碎的程度大于70%。

    4. 转移裂解液到预冷的1.5ml离心管中,冰上放置10分钟,期间剧烈涡旋2-3次,于4℃,16000rpm离心10min,弃沉淀,上清移至新的离心管中。

    5.含上清的离心管37℃水浴10min,室温,13000rpm离心5分钟,样品分成上层与下层(含膜蛋白)。

    建议使用进口的透明度高的离心管,方便观察分层,在分层交界处有一折光线,需仔细观察才可以见到。

    6.  取下层,加入500ul冰冷灭菌水混匀,4℃放置5min后,置于37℃水浴10min。

    7.  室温,13000rpm离心5分钟,样品分成上层与下层(含膜蛋白)。

    8. 重复第6,7步操作一次,最终取下层即为膜蛋白提取物。BCA法测定蛋白浓度。

    9. 每100ul膜蛋白提取物加入900ul预冷的丙酮,混匀冰浴20min,16000rpm离心15min。

    10. 弃上清,沉淀真空干燥或敞盖冰浴10min,用含巯基乙醇或DTT适量的loading buffer溶解沉淀。如沉淀难以溶解,可以加入尿素或硫脲等强溶解力试剂。

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