产品简介

Water RNA Kit提供了从各种来源的水体样品中快速简便的提取基因组RNA的方法。水体样品中存在大量微生物，这些微生物被作为重要的生态指示剂被广泛应用。从水体中提取高纯度的基因组RNA是水体环境值检测非常重要的手段。水体样品中含有大量的抑制因子如腐殖酸、金属离子等，这些物质即使微量存在于纯化后的RNA中也会对下游反应产生影响，如对PCR、限制性酶切等。因而纯化水体RNA的关键在于如何有效的去除水体中的抑制因子。

试剂盒组成

储存和稳定性

室温保存，一年有效。Buffer RC2与Buffer RC3可能有沉淀产生，37℃水浴溶解后即可。

实验前准备

请详细阅读该手册并熟悉各个步骤，在开始之前准备好所有的试剂盒组分和必需的器材。

浓缩的RNA Wash Buffer需用无水乙醇按如下稀释：

R1801 加16 ml；R1805加入52 ml ；R1806与R1807每瓶加入104 ml 无水乙醇

浓缩的Buffer RC5需用异丙醇按如下稀释：

R1801 加7ml；R1805加入35ml ；R1806与R1807每瓶加入63ml异丙醇

浓缩的Buffer WB需用无水乙醇按如下稀释：

l   R1801 加6 ml；R1805加入14ml ；R1806加入28ml，R1807加入56ml 无水乙醇

标准操作步骤

1.       使用直径为47mm，孔径为0.22-0.45μm的滤膜对水体样品进行过滤，过滤体积取决于水体样品的浊度和微生物的含量。用剪刀将1/2张或整张过滤后的滤膜尽量剪碎，置于2ml离心管中，以便于后面的裂解步骤。

2.      加入0.4g Glass Beads，再加入1.2ml Buffer RC1与50μl Buffer RC2。涡旋器高速震荡3-5min。

注意： Buffer RC2是我司独特的腐殖酸除去剂，50μl对大部分样品来说足以有效除去腐殖酸等抑制因子。对一些腐殖酸含量特别丰富的土壤， Buffer RC2的量可以适当增加，但不能超过150μl，否则会严重影响RNA的得率。

2. 加入250μl Buffer RC3（C3如有沉淀37℃水浴完全溶解后再用），涡旋1-2min。70℃水浴处理10min。期间振荡几次。

注意：如果要纯化革兰氏阳性菌的RNA，请在70℃处理完后，再90℃水浴处理2min。

3. 12000 rpm(~13000×g)离心1钟，转1ml上清到1.5ml离心管中，加入200μl BufferC4混匀。

注意：转移上清时确保不要吸取到沉淀，转移的上清量最好不超过80%。

4. 冰上放置5min。12000 rpm(~13000×g)离心1钟。 转移上清到新的2.0ml离心管中。

注意：转移上清时确保不要吸取到沉淀，转移的上清量最好不超过80%。

5.加入与上清等体积 Buffer RC5（使用前请先检查是否已加入异丙醇），混匀。

注意：Buffer WB使用前须按要求用无水乙醇稀释。如果放入冰箱中，使用前须恢复到室温。

6.取750μl混合液加到GBC吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30秒，倒掉滤过液。

7. 重复第六步，将剩余的混合液过GBC吸附柱。

8. 向GBC吸附柱中加入500μl Buffer WB，12,000 rpm (~13,000×g ) 离心30 秒，倒掉废液。

9. 向GBC吸附柱 中加入600μl RNA Wash Buffer（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,000×g ) 离心30 秒，倒掉废液，GBC吸附柱放入收集管中。

10. 向GBC吸附柱 中加入600μlRNA Wash Buffer，12,000 rpm (~13,000×g ) 离心30秒，倒掉废液，将GBC吸附柱放入收集管中。

11. 12,000 rpm(~13,000×g)离心2 分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

12. 将GBC吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μl洗脱缓冲液TE或灭菌去离子水,室温放置2min。

13. 室温下，离心(>13.000)1min，以洗脱RNA。保留含RNA的流出液。